• mothur trim.seqs 去除PCR引物


    trim.seqs 有以下几个主要应用:

    1)根据barcode 拆分序列;

    2)去除PCR引物

    3) 去除低质量序列

    trim.seqs 在使用时必须输入一个fasta 格式的序列,然后在加至少一个的选项;其选项有很多,下面一一介绍:

    1)oligos: 从字面意义看是寡聚核苷酸, 这里是指barcode 和 PCR 引物的序列,这个选项对应的是一个文件,文件内容如下:

    forward	CATGCTGCCTCCCGTAGGAGT
    #reverse	TCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG
    barcode	AACCAACC	ALP50M
    barcode	AACCAAGG	AZAC1
    barcode	AACCATCG	ALP2B
    barcode	AACCATGC	ALP1B
    barcode	AACCGCAT	ALP80M
    barcode	AACCGCTA	ALPG2
    barcode	AACCGGAA	AZ273

    forward和reverse代表PCR引物,barcode 代表多个样本混测时区分样本的index序列

    在这个文件中,不同字段是 分隔,需要注意的是mothur 认为的forward引物一定出现在序列的起始,reverse引物出现在序列的末尾,在使用mothur去除pCR引物时,实际两个方向都需要考虑;mothur允许PCR引物中有兼并碱基,只要符合IUPAC规定的碱基都是可以的

    用法:

    mothur "#trim.seqs(fasta=test.fa,oligos=primer)"

    会输出两个文件:

    *trim.fasta: 这个文件是去除PCR引物之后的序列, 处理成功之后的序列如下:

    >1	bdiffs=0(match) fpdiffs=0(match) rpdiffs=0(match) 	
    AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

    在序列标识符中,bdiffs 代表 barcode difference num , fpdiffs 和 rpdiffs 分别代表 forward primer difference num 和 reverse difference num

    *scrap.fasta : 这个文件是处理失败的序列,失败的原因是没有找到PCR引物,序列如下:

    >2|r	bdiffs=0(match) fpdiffs=0(match) rpdiffs=1000(noMatch) 	
    CGATCGATCGATCGACAAAAAAAAAAAAAAAAA

    在序列标识符中,会给出失败的原因,比如这里的"2|r", 代表在这条序列中没有找到反向引物,可以看到 rpdiffs = 1000 (noMatch), 当没有找到时,错配数直接设置成1000

    备注:在oligos 文件中,输入的引物都方向都是5’->3', mothur在查找引物的时候,会在序列的5’端查找正向引物,在序列的3’端查找反向引物的反向互补序列。

    参考资料:

      https://www.mothur.org/wiki/Trim.seqs

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