• 一文读懂:DNA甲基化的作用及各种高通量检测方法比较


    DNA甲基化相关定义

    DNA甲基化一直以来都是表观遗传学领域研究的重点之一。DNA甲基化(Methylation)是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, 缩写DNMT)的作用下,基因组DNA序列上CpG岛的二核苷酸5′端胞嘧啶转变为5′甲基胞嘧啶(5′ methylcytosine, 缩写5mC)。这种DNA修饰的方式并未改变基因的序列, 但能抑制某些基因的表达。在哺乳动物中,基因组DNA的甲基化可分为两种类型:维持甲基化(maintenance DNA methylation)和重新甲基化(de novo methylation)

    维持甲基化是指在甲基转移酶的作用下,DNA的半保留复制过程中,会在子链的相应的位置进行甲基化修饰的过程。重新甲基化是指在甲基转移酶的作用下,原来没有甲基化的DNA双链上,进行甲基化的过程,之后由维持甲基化酶来维持稳定的DNA甲基化状态。对于这两种甲基化机制来说,有两种对应类型的甲基化酶:维持甲基转移酶和重新甲基转移酶。在哺乳动物中,较为常见的DNA甲基化转移酶(DNMT)主要有:DNMTl、DNMT3a、DNMT3b。而去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达。

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    胞嘧啶甲基化和去甲基化机器的结构域及酶活性(Wu et al. 2014, Cell)

    DNA甲基化的作用

    DNA甲基化的生物学功能主要可以分为三类:

    1)基因组序列C-->T的突变,如很多实体瘤患者出现抑癌基因p53 的突变, 而该基因的很多突变是CpG甲基化后脱氨引起的C-->T突变;

    2)影响基因组错配的修复,研究表明DNA错配修复系统(mismatchrepairsystem, MMR)与DNA甲基化有关;

    3)基因沉默,即影响基因的表达。

    在真核生物中,大约60%~90%的CpG 二核苷酸中的胞嘧啶都呈现出了甲基化状态(Ehrlich et al., 1982)。DNA甲基化在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、寄生DNA序列的抑制、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、及肿瘤和疾病的发生、发展紧密相关,具有至关重要的作用。已有的研究表明胚胎的正常发育非常依赖于基因组DNA的适当甲基化,任何一种甲基转移酶的缺失,都可导致小鼠胚胎发育的中止而死亡。此外,各种肿瘤中都普遍存在DNA甲基化状态的异常改变,且异常的DNA甲基化状态是肿瘤的重要特征之一。小鼠的体外实验和体内实验都已表明,全基因组水平的去甲基化可能导致整个基因组的不稳定,从而增加肿瘤的发生几率。而且,抑癌基因启动子区域CpG 岛的高甲基化,是诸多癌症发生早期的重要事件之一。因此,探索肿瘤中DNA 的去甲基化的机制对于了解肿瘤的发生、发展至关重要。


    DNA甲基化与癌症的关系(Robertson KD, Nat Rev Genet. 2005)

    DNA甲基化的检测

    至今,DNA甲基化检测技术已经有了突飞猛进的变化,若按照“样品前处理”的方式,则可分为:

    1)酶切法(Enzyme digestion);

    2)亲和富集法(Affinity enrichment);

    3)亚硫酸盐处理(Sodium bisulphite);


    三种类型方法的综合比较(Barros-Silva et al. Genes, 2018)

    而按照“分析步骤”则又可细分为:

    1)位点特异性分析(Locus-specific analysis);

    2)凝胶分析(Gel-based analysis);

    3)全基因组高覆盖率的芯片分析(Array—based analysis);

    4)基于新一代测序技术的甲基化分析(NGS-based analysis)。

    具体如下图所示:


    主要的DNA甲基化研究方法(Peter W. Laird, Nat Rev Genet. 2010)。缩写与全称为:AIMS, amplification of inter-methylated sites; BC–seq, bisulphite conversion followed by capture and sequencing; BiMP, bisulphitemethylation profiling; BS, bisulphite sequencing; BSPP, bisulphite padlock probes; CHARM, comprehensive high-throughput arraysfor relative methylation; COBRA, combined bisulphite restriction analysis; DMH, differential methylation hybridization; HELP, HpaIItiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR; MCA, methylated CpG island amplification; MCAM, MCA with microarrayhybridization; MeDIP, mDIP and mCIP, methylated DNA immunoprecipitation; MIRA, methylated CpG island recovery assay;MMASS, microarray-based methylation assessment of single samples; MS-AP-PCR, methylation-sensitive arbitrarily primed PCR;MSCC, methylation-sensitive cut counting; MSP, methylation-specific PCR; MS-SNuPE, methylation-sensitive single nucleotideprimer extension; NGS, next-generation sequencing; RLGS, restriction landmark genome scanning; RRBS, reduced representationbisulphite sequencing; –seq, followed by sequencing; WGSBS, whole-genome shotgun bisulphite sequencing.

    随着测序技术的发展,测序价格越来越低,而通量越来越高,且测序可实现单碱基的分辨率,基于测序的甲基化检测技术已逐渐成为主流。下图展示了基于测序的DNA甲基化解析技术的发展流程:


    基于二代测序的DNA甲基化检测技术发展历程(Barros-Silva et al. Genes, 2018)。缩写与全称:BS-Seq: bisulfite sequencing; MeDIP-Seq: methylated DNA immunoprecipitation sequencing;RRBS-Seq: reduced representation bisulfite sequencing; WGBS: whole genome bisulfite sequencing;MethylCap-Seq: methylation capture sequencing; MBD-Seq: methyl-CpG binding domain sequencing;oxBS.Seq: oxidative bisulfite sequencing; TAB-Seq: TET-associated bisulfite sequencing; BSAS: bisulfiteamplicon sequencing.

    常用的甲基化检测方法具体如下图所示:


    常用的甲基化检测方法示意图(Yong et al. Epigenetics & Chromatin, 2016)
     

    1)蛋白质富集全基因组甲基化测序(Methylated DNA Binding Domain Sequencing, MBD-Seq或MBDCap-seq)

    为一种采用甲基化DNA富集与高通量测序技术相结合的DNA甲基化检测方法。主要通过特异性结合甲基化DNA的蛋白MBD2b去富集高甲基化的DNA片段,然后结合高通量测序技术,对富集到的DNA片段进行测序,从而可在全基因组范围内检测甲基化位点。

    2)甲基化DNA免疫共沉淀测序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing, MeDIP-Seq)

    其采用的甲基化DNA免疫共沉淀技术。首先通过5'-甲基胞嘧啶抗体去特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,接着通过高通量测序在全基因组水平上对CpG密集的高甲基化区域进行研究。这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域,如CpG岛,但不能进行单个碱基水平的分析。

    3)TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq) 

    原理是采用葡萄糖亚胺与5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用使其免受TET蛋白的氧化。而5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶,从而可从单碱基水平鉴定5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)。

    4)限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)

    RRBS通过限制性内切酶对基因组DNA序列进行酶切,然后富集启动子及CpG岛区域,接着再进行Bisulfite转化,从而用较小的数据量就可得到包含最多CpG位点的单碱基水平的甲基化图谱。总的来说,是一种准确且高性价比的DNA甲基化检测方法,适用于大规模临床样本的研究。

    5)全基因组DNA甲基化测序(Whole-genome bisulfite sequencing,WGBS)

    其原理是用 Bisulfite 处理DNA序列,首先将基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 U(T),从而与原本具有甲基化修饰的  碱基C区分开来,然后进行PCR扩增,结合高通量测序技术,适用于全基因组 范围内绘制单碱基分辨率的DNA 甲基化图谱。

    下表列出了不同甲基化检测技术的特点,及可能存在的bias:


    不同甲基化检测技术的特点及可能的bias(Peter W. Laird, Nat Rev Genet. 2010)。标注含义:‘•’ indicates that the method has this feature or potentially has this bias; ‘(•)’ indicates that the method has this feature to a limited extent or in some circumstances.BC–seq, bisulphite conversion followed by capture and sequencing; BSPP, bisulphite padlock probes; –chip, followed by microarray; MeDIP, methylated DNAimmunoprecipitation; RRBS, reduced representation bisulphite sequencing; –seq, followed by sequencing; WGSBS, whole-genome shotgun bisulphite sequencing.

    此外,不同甲基化检测技术,拥有不同通量和基因组甲基化检测覆盖度,具体如下图所示:


    甲基化检测技术的样本通量及基因组覆盖度比较(Peter W. Laird, Nat Rev Genet. 2010)

    所以,各种甲基化检测技术都有自己的优点和缺点,其中全基因组DNA甲基化测序(WGBS)可获得全基因组范围内单碱基分辨率的所有DNA甲基化情况,信息最为丰富和全面。

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