DNA甲基化相关定义
DNA甲基化一直以来都是表观遗传学领域研究的重点之一。DNA甲基化(Methylation)是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, 缩写DNMT)的作用下,基因组DNA序列上CpG岛的二核苷酸5′端胞嘧啶转变为5′甲基胞嘧啶(5′ methylcytosine, 缩写5mC)。这种DNA修饰的方式并未改变基因的序列, 但能抑制某些基因的表达。在哺乳动物中,基因组DNA的甲基化可分为两种类型:维持甲基化(maintenance DNA methylation)和重新甲基化(de novo methylation)。
维持甲基化是指在甲基转移酶的作用下,DNA的半保留复制过程中,会在子链的相应的位置进行甲基化修饰的过程。重新甲基化是指在甲基转移酶的作用下,原来没有甲基化的DNA双链上,进行甲基化的过程,之后由维持甲基化酶来维持稳定的DNA甲基化状态。对于这两种甲基化机制来说,有两种对应类型的甲基化酶:维持甲基转移酶和重新甲基转移酶。在哺乳动物中,较为常见的DNA甲基化转移酶(DNMT)主要有:DNMTl、DNMT3a、DNMT3b。而去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达。
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DNA甲基化的作用
DNA甲基化的生物学功能主要可以分为三类:
1)基因组序列C-->T的突变,如很多实体瘤患者出现抑癌基因p53 的突变, 而该基因的很多突变是CpG甲基化后脱氨引起的C-->T突变;
2)影响基因组错配的修复,研究表明DNA错配修复系统(mismatchrepairsystem, MMR)与DNA甲基化有关;
3)基因沉默,即影响基因的表达。
在真核生物中,大约60%~90%的CpG 二核苷酸中的胞嘧啶都呈现出了甲基化状态(Ehrlich et al., 1982)。DNA甲基化在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、寄生DNA序列的抑制、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、及肿瘤和疾病的发生、发展紧密相关,具有至关重要的作用。已有的研究表明胚胎的正常发育非常依赖于基因组DNA的适当甲基化,任何一种甲基转移酶的缺失,都可导致小鼠胚胎发育的中止而死亡。此外,各种肿瘤中都普遍存在DNA甲基化状态的异常改变,且异常的DNA甲基化状态是肿瘤的重要特征之一。小鼠的体外实验和体内实验都已表明,全基因组水平的去甲基化可能导致整个基因组的不稳定,从而增加肿瘤的发生几率。而且,抑癌基因启动子区域CpG 岛的高甲基化,是诸多癌症发生早期的重要事件之一。因此,探索肿瘤中DNA 的去甲基化的机制对于了解肿瘤的发生、发展至关重要。
DNA甲基化的检测
至今,DNA甲基化检测技术已经有了突飞猛进的变化,若按照“样品前处理”的方式,则可分为:
1)酶切法(Enzyme digestion);
2)亲和富集法(Affinity enrichment);
3)亚硫酸盐处理(Sodium bisulphite);
而按照“分析步骤”则又可细分为:
1)位点特异性分析(Locus-specific analysis);
2)凝胶分析(Gel-based analysis);
3)全基因组高覆盖率的芯片分析(Array—based analysis);
4)基于新一代测序技术的甲基化分析(NGS-based analysis)。
具体如下图所示:
随着测序技术的发展,测序价格越来越低,而通量越来越高,且测序可实现单碱基的分辨率,基于测序的甲基化检测技术已逐渐成为主流。下图展示了基于测序的DNA甲基化解析技术的发展流程:
常用的甲基化检测方法具体如下图所示:
1)蛋白质富集全基因组甲基化测序(Methylated DNA Binding Domain Sequencing, MBD-Seq或MBDCap-seq)
为一种采用甲基化DNA富集与高通量测序技术相结合的DNA甲基化检测方法。主要通过特异性结合甲基化DNA的蛋白MBD2b去富集高甲基化的DNA片段,然后结合高通量测序技术,对富集到的DNA片段进行测序,从而可在全基因组范围内检测甲基化位点。
2)甲基化DNA免疫共沉淀测序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing, MeDIP-Seq)
其采用的甲基化DNA免疫共沉淀技术。首先通过5'-甲基胞嘧啶抗体去特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,接着通过高通量测序在全基因组水平上对CpG密集的高甲基化区域进行研究。这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域,如CpG岛,但不能进行单个碱基水平的分析。
3)TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq)
原理是采用葡萄糖亚胺与5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用使其免受TET蛋白的氧化。而5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶,从而可从单碱基水平鉴定5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)。
4)限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)
RRBS通过限制性内切酶对基因组DNA序列进行酶切,然后富集启动子及CpG岛区域,接着再进行Bisulfite转化,从而用较小的数据量就可得到包含最多CpG位点的单碱基水平的甲基化图谱。总的来说,是一种准确且高性价比的DNA甲基化检测方法,适用于大规模临床样本的研究。
5)全基因组DNA甲基化测序(Whole-genome bisulfite sequencing,WGBS)
其原理是用 Bisulfite 处理DNA序列,首先将基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 U(T),从而与原本具有甲基化修饰的 碱基C区分开来,然后进行PCR扩增,结合高通量测序技术,适用于全基因组 范围内绘制单碱基分辨率的DNA 甲基化图谱。
下表列出了不同甲基化检测技术的特点,及可能存在的bias:
此外,不同甲基化检测技术,拥有不同通量和基因组甲基化检测覆盖度,具体如下图所示:
所以,各种甲基化检测技术都有自己的优点和缺点,其中全基因组DNA甲基化测序(WGBS)可获得全基因组范围内单碱基分辨率的所有DNA甲基化情况,信息最为丰富和全面。
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