激活qiime2的执行环境：source activate qiime2-2019.4
如何查看conda已有的环境：conda info -e
以下分析流程参考：https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/qiime2-for-experienced-microbiome-researchers/
1、数据准备
现在我们常用的就是这种格式的数据，每个样品一对数据文件
数据来源：https://docs.qiime2.org/2019.7/tutorials/importing/
wget -O "casava-18-paired-end-demultiplexed.zip" "https://data.qiime2.org/2019.4/tutorials/importing/casava-18-paired-end-demultiplexed.zip"
下载解压后，文件夹中文件如下：
2、将数据转换为qza格式（qiime新定义的自己的格式类型，有点编程中对象的含义）
qiime tools import --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' --input-path casava-18-paired-end-demultiplexed --input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt --output-path demux-paired-end.qza
3、查看数据质量
qiime demux summarize --i-data demux-paired-end.qza --o-visualization demux-summary-1.qzv
用以下命令查看结果：
qiime tools view demux-summary-1.qzv
4、双端序列合并成单端
qiime vsearch join-pairs --i-demultiplexed-seqs demux-paired-end.qza --o-joined-sequences demux-joinded.qza
5、查看对merge后的数据质量情况
qiime demux summarize --i-data demux-joinded.qza --o-visualization demux-summary-merged.qzv
qiime tools view demux-summary-merged.qzv
##### 以下是使用dada2进行数据去噪，本教程先跳过该步，之后有专门教程介绍dada2使用
4、对数据进行剪切
双端：
qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs demux-paired-end.qza --p-trim-left-f 13 --p-trim-left-r 13 --p-trunc-len-f 150 --p-trunc-len-r 150 --o-table table.qza --o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza
单端：
qiime dada2 denoise-single
--i-demultiplexed-seqs demux-joinded.qza #输入应该也是序列，不能是joined对象
--p-trim-left 13
--p-trunc-len 150
--o-table table.qza
--o-representative-sequences rep-seqs-merged.qza
--o-denoising-stats denoising-stats-merged.qza
https://forum.qiime2.org/t/demultiplexing-and-trimming-adapters-from-reads-with-q2-cutadapt/2313
以下参考：
https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/86685524
https://mp.weixin.qq.com/s/6cLzyJjWQmHm82_U6euJ1g
5、序列质控
qiime quality-filter q-score-joined
--i-demux demux-joinded.qza
--o-filtered-sequences demux-joined-filtered.qza
--o-filter-stats demux-joined-filter-stats.qza
输出结果:
- demux-joined-filter-stats.qza: 统计结果
- demux-joined-filtered.qza: 数据过滤后结果
6、用deblur去冗余，并生成特征表（相当于QIIME1的OTU Table）
qiime deblur denoise-16S
--i-demultiplexed-seqs demux-joined-filtered.qza
--p-trim-length 250
--p-sample-stats
--o-representative-sequences rep-seqs.qza
--o-table table.qza
--o-stats deblur-stats.qza
输出结果:
- rep-seqs.qza: 代表序列
- deblur-stats.qza: 统计过程
- table.qza: 特征表
备注：
由于DADA2和Deblur产生的“OTU”是通过对唯一序列进行分组而创建的，因此这些OTU相当于来自QIIME 1的100%相似度的OTU，通常称为序列变体。在QIIME 2中，这些OTU比QIIME 1默认的97%相似度聚类的OTU具有更高的分辨率，并且它们具有更高的质量，因为这些质量控制步骤比QIIME 1中实现更好。因此，与QIIME 1相比，可以对样本的多样性和分类组成进行更准确的估计。
7、查看deblur去冗余后的特征表
qiime feature-table summarize
--i-table table.qza
--o-visualization table.qzv
--m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv
qiime feature-table tabulate-seqs
--i-data rep-seqs.qza
--o-visualization rep-seqs.qzv
qiime tools view table.qzv
8、统计每个样品包含的序列数
qiime deblur visualize-stats
--i-deblur-stats deblur-stats.qza
--o-visualization deblur-stats.qzv
qiime tools view deblur-stats.qzv
9、构建进化树用于多样性分析
qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree
--i-sequences rep-seqs.qza
--o-alignment aligned-rep-seqs.qza
--o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza
--o-tree unrooted-tree.qza
--o-rooted-tree rooted-tree.qza
10、需要先准备一个metadata文件，文件说明参考：https://docs.qiime2.org/2019.7/tutorials/metadata/
11、计算核心多样性
qiime diversity core-metrics-phylogenetic
--i-phylogeny rooted-tree.qza
--i-table table.qza
--p-sampling-depth 500
--m-metadata-file sample-metadata.tsv
--output-dir core-metrics-results
分析结果包含：
-
α多样性
-
香农(Shannon’s)多样性指数（群落丰富度的定量度量，即包括丰富度
richness和均匀度evenness两个层面） -
Observed OTUs（群落丰富度的定性度量，只包括丰富度）
-
Faith’s系统发育多样性（包含特征之间的系统发育关系的群落丰富度的定性度量）
-
均匀度（或 Pielou’s均匀度；群落均匀度的度量）
-
β多样性
-
Jaccard距离（群落差异的定性度量，即只考虑种类，不考虑丰度）
-
Bray-Curtis距离（群落差异的定量度量）
-
非加权UniFrac距离（包含特征之间的系统发育关系的群落差异定性度量）
-
加权UniFrac距离（包含特征之间的系统发育关系的群落差异定量度量）
β多样性分析结果-PCoA：
12、Alpha多样性组间显著性分析和可视化
qiime diversity alpha-group-significance
--i-alpha-diversity core-metrics-results/faith_pd_vector.qza
--m-metadata-file sample-metadata.tsv
--o-visualization core-metrics-results/faith-pd-group-significance.qzv
qiime diversity alpha-group-significance
--i-alpha-diversity core-metrics-results/evenness_vector.qza
--m-metadata-file sample-metadata.tsv
--o-visualization core-metrics-results/evenness-group-significance.qzv
13、绘制稀疏曲线
qiime diversity alpha-rarefaction
--i-table table.qza
--i-phylogeny rooted-tree.qza
--p-max-depth 1000
--m-metadata-file sample-metadata.tsv
--o-visualization alpha-rarefaction.qzv
--p-max-depth参数的值应该通过查看上面创建的table.qzv文件中呈现的“每个样本的测序量”信息来确定。一般来说，选择一个在中位数附近的值似乎很好用。
14、物种组成分析
下载物种注释数据库制作的分类器：
wget
-O "gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza"
"https://data.qiime2.org/2018.11/common/gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza"
物种注释和可视化
qiime feature-classifier classify-sklearn
--i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza
--i-reads rep-seqs.qza
--o-classification taxonomy.qza
qiime metadata tabulate
--m-input-file taxonomy.qza
--o-visualization taxonomy.qzv
生成物种组成柱状图：
qiime taxa barplot
--i-table table.qza
--i-taxonomy taxonomy.qza
--m-metadata-file sample-metadata.tsv
--o-visualization taxa-bar-plots.qzv
