• 3、PACBIO下机数据如何看


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    三代测序的下机数据都有哪些,以及他们具体的格式是怎么样的(以sequel 平台为主)。

    测序过程

    SMRTbell


        A adapter通用接头,两端的接头可以一样也可以不一样
        B barcode(客户自己设计)
        I insert 插入片段,即我们测序的目的片段
        由于SMRTbell是环状的,测序过程是边合成边测序,因此可以沿着新链合成的方向不停地读取序列,读取一圈又一圈,直到聚合酶累趴下了…

    测序结果

        根据SMRTbell的形状以及测序的过程,我们容易知道,测序出来的reads如上图所示,由接头序列, 条码序列, 插入序列间隔线性分布,即ABIB-ABIB—ABIB-ABIB—…(A: adapter, B: barcode, I: insert)
        ZMW read 是测序出来的完整结果,也即是polymerase read,聚合酶合成过的所有的序列。
        PostPrimary 分析后输出HQ region,由ZMW read 去除两端低质量区域得到。

    收到的测序文件

    RS II

    Sequel

        在下机文件中,主要有三类文件,bam 文件,bam.pbi 文件,以及xml文件。
        当我们习惯性的去寻找熟悉的fastq格式文件做分析时,忽然发现找不到了,因为在sequel平台中bam 文件成为了它的替代者,因为其更节约储存空间。这是文件格式的一个重大更新。
        用于后续分析的文件一般是.subreads.bam,这等同于RS II 中的.subreads.fastq
        下面仔细聊聊三类主要文件的具体格式,以及他们分别干什么活的。

    Pacbio 的BAM 文件格式

        我们平常见到的bam文件大多是比对结果文件,例如用重测序分析中BWA生成的bam文件就是reads与基因组的比对文件。但pacbio的下机文件是没有与基因组进行过比对过的,其主要作用就是储存序列。
        Bam文件主要分为两个部分,头一部分是Header,储存测序的相关信息,另一部分也即是文件的主要部分是records,这里头保存了我们的序列信息。我们这里就以subreads.bam文件为例,分析下bam文件的具体格式。
        可以用samtools view 命令查看bam文件

        第一列:reads信息
    {movieName}/{holeNumber}/{qStart}_{qEnd}
    [对于CCS:{movieName}/{holeNumber}/ccs]
    MovieName 是cell的名字,holeNumer是ZMW孔的编号,qStart和qEnd是subreads相对于ZMW reads的位置。
        第二列 (sum of flags):比对信息 均为4 代表没有比对上,也表明了bam文件只储存了序列信息,而没有比对信息。
        第三列 (RNAM):参考序列 值为 ,代表无参考序列
        第四列 (position) : 比对上的第一个碱基位置 0
        第五列 (Mapping quality) : 比对质量分数 255
        第六列 (CIGAR值) : 比对的具体情况 
        第七列 (MRNM, ) : mate 对应的染色体 
        第八列 (mate position) : mate对应的位置 0
        第九列 (ISIZE, Inferred fragment size) : 推断的插入片段大小 0
        第十列 (Sequence) : 序列信息 具体的ATCG
        第十一列 (ASCII码) : 碱基质量分数 ASCII+33
        第十二列 : 可选区域 记录Reads 的总体属性包括信号长度,信号强度等信息。

    BAM 文件分别都是些什么?

    1. zmws.bam 以及ccs.bam似乎公司并不一定会提供

    2. 经过检查,一条zmw reads 可以产生多条 subreads,也就是说subreads.bam 中,序列只是被剪下来了。

    3. scraps.bam 格式保存的是获取subreads时废弃的序列,包括adapter,以及一些低质量的序列

    4. CCS.bam保存的是矫正后的一致性序列。

    BAM.pbi 文件

        是bam文件的索引文件(PacBio BAM index),与上一个版本(RS II)的*cmp.h5文件兼容,其格式类似于HDF5, 通过BGZF格式压缩。
        其存在主要有两个作用

    随机访问

        通过参考序列,基因组区域
        通过read 组别
        通过qurey name
        通过ZMW
        通过barcode
        其他

    在无需完全访问BAM文件的情况下,获取信息

        获取统计信息

        通过提供index访问记录信息

    XML 文件

        MetaData, 储存数据描述。可用于filter 或者subset等功能。

        sts.xml 储存数据的统计信息。

        SMRT Link CL tools in 5.0.0 dataset命令可以进行方便的操作。

    参考资料
    http://pacbiofileformats.readthedocs.io/en/5.0/

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