Circular RNA的产生机制、功能及RNA-seq数据鉴定方法

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【Circular RNA的产生机制】

Circular RNA，缩写为circRNA，中文名为环状RNA，属于非编码RNA，是近年的一个重要研究热点。

CircRNA主要是通过backsplicing的方式产生，明显不同于线性RNA（linear RNA）经典的5′–3′的模式。因此，circRNA不含有线性RNA的经典结构，如5′端加帽，3′端有poly A尾巴等，而是形成了一个环状。

CircRNA按照含有的外显子和内含子模式，主要可以分为以下四类：

1）单外显子circRNA，single exon circRNA；

2）多外显子circRNA，multi-exon circRNA；

3）外显子和内含子共存的circRNA，exon-intron circRNA；

4）内含子circRNA，intronic circRNA；

具体如下图所示：

CircRNA的四种主要类型示意图（图片来源：Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

CircRNA的表达模式多样且复杂（具体如下图所示）。比如GCN1L1基因产生的circRNA在人类中明显表达，但在小鼠中却很少表达（如下图B所示）。而且，circRNA的剪接模式多样，其中，alternative back-splicing有5′端和3′端两种模式，alternative splicing模式有Cassette exon，Alternative 5' splicing，Intron retention和Alternative 3' splicing四种不同模式（具体如下图C所示）。

CircRNA表达模式的复杂性（图片来源：Li et al. Molecular Cell, 2018）

【Circular RNA的生物学功能】

越来越多的研究表明，circRNA具有多种重要的功能，且与各种疾病特别是癌症的发生、发展密切相关。其中，circRNA发挥功能的两种常见模式，是作为miRNA和RNA绑定蛋白（RNA binding protien，RBP）的sponges（具体如下图所示）。

CircRNA作为miRNA和蛋白的sponges示意图（图片来源：Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

除此之外，circRNA还有其他重要的潜在功能，如可翻译产生蛋白（如下图VI所示）、假基因的产生来源（如下图VII所示）、作为潜在生物标志物（如下图VIII所示）。所以，circRNA具有非常多样的生物学功能，这也奠定了其重要的研究地位。

CircRNA的各种潜在功能机制示意图（图片来源：Li et al. Molecular Cell, 2018）

 

【Circular RNA与疾病特别是癌症的关系】

目前，已经有很多研究表明，circRNA与各种疾病特别是癌症的发生发展密切相关。如下面Table 1所示的一些circRNA可以作为miRNA的sponges，且在特定的肿瘤中起到了肿瘤抑制基因或致癌基因的功能。

一些在肿瘤中起到肿瘤抑制基因或致癌基因功能的circRNA（Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

下表还显示了，一些已报道的与局部缺血性心脏病、阿尔兹海默症、糖尿病相关的重要circRNA，它们的具体作用机制可见下面的Table 2所示。

CircRNA在局部缺血性心脏病、阿尔兹海默症、糖尿病中具有重要的功能（Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

此外，已有的研究还报道了circRNA与各种人类癌症密切相关，在相应的癌症中，这些circRNA的表达显著上调或显著下调。这些癌症包括：Gastric Cancer，Colon Cancer，Bladder Cancer，Hepatocellular Cancer，Oesophageal Cancer，Lung Cancer等。具体如下面的Table 3所示。

一些已知的circRNA与各种人类的癌症紧密相关（Greene et al. Frontiers in Molecular Biosciences, 2017）

【Circular RNA的RNA-seq鉴定及实验验证方法】

CircRNA可以通过RNA-seq技术进行大规模的鉴定。因为circRNA不含有poly A尾巴，所以circRNA主要富集在没有ploy A尾巴的RNA中，建议使用poly (A)- RNA-seq技术或 用RNase R降解线性RNA后的poly (A)- RNA-seq技术（具体如下图A所示）。传统的poly (A)+ RNA-seq技术主要富集了线性的RNA；而ribo- RNA-seq技术，主要只去除了核糖体RNA（rRNA）。

进行RNA测序后，就可以使用生物信息学工具或方法在全基因组范围内鉴定circRNA。目前基于RNA-seq测序数据鉴定circRNA的方法主要是通过检测是否有read能匹配到back-splicing junction (BSJ) site，即circRNA的首和尾连接处的序列（具体如下图A中的右图所示）。​

基于RNA-seq数据鉴定出circRNA后，如果想进一步确认鉴定结果的可靠性，还可通过实验来验证预测的circRNA。如通过PCR、Northern blot或RNA FISH等（具体如下图B所示）。

CircRNA的生物信息学鉴定（A）和实验验证方法（B）（图片来源：Li et al. Molecular Cell, 2018）

至今为止，已经有众多软件相继被开发出来基于RNA-seq数据鉴定circRNA，这些软件使用的方法主要可以分为以下三大类：

1）Indirect and Multi-Stage Approaches；

2）Approaches Directly Employing Chimeric Reads；

3）Tools Using Statistical Approaches。

 

下表列出了一些基于RNA-seq数据鉴定circRNA的主要软件：

基于RNA-seq数据鉴定circRNA的一些主要软件信息（图片来源：Jakobi et al. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2019）

而且，目前已有多个关于circRNA的数据库可供大家使用，这些数据库中含有了丰富的circRNA信息，包括circRNA-miRNA相互作用、circRNA-RBP相互作用等（具体如下表）。

关于circRNA的一些重要数据库信息（图片来源：Jakobi et al. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2019）

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