【转载】RNA-seq测序方法

参考：

https://zhuanlan.zhihu.com/p/26319993

https://cloud.tencent.com/developer/article/1483493

常规的RNA测序分三大类：转录组测序（我们平时最多提到的RNA-seq）、小RNA测序、以及近两年比较火热的环状RNA测序。

• 转录组测序主要针对线性的mRNA以及lncRNA（长非编码RNA）；
• 小RNA测序主要针对18~40个nt的小分子 RNA（比如miRNA、snoRNA等），需要在构建文库之前通过片段选择富集小分子RNA；
• 环状RNA测序则需要先使用RNase R降解掉线性RNA分子。Ribo-zero

移除rRNA（95%的rRNA，保守，组织间稳定，没有用）的方法：有两种方法，一种是将rRNAs从总RNA中分离出来（所谓的pull-out法），另一种是使用RNAse H酶降解rRNA。

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RNA-seq测序方法

1. 在测mRNA过程中，首先要去除rRNA。以人为例，在抽提的总RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的则是lncRNA、microRNA、siRNA等。

2. rRNA整个人类当中是非常保守的，在各个组织器官中也是非常稳定的，因此这些测序结果对我们的研究是没有用处的。mRNA则是RNA中比较重要的部分。

3. Illumina公司的Truseq RNA建库方法是应用最广泛的一种，真核普通转录组为例：

   • 首先以mRNA的Poly(A)(高等生物特有的)这个特点，让带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，使mRNA和磁珠相结合在一起。
   • 接着回收磁珠，将带有Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
   • 然后用镁离子溶液将洗脱下来的mRNA打成片段，被打断的mRNA片段用随机引物逆转录出第一链的cDNA，再合成出第二链，这样就有了双链cDNA。
   • 对双链cDNA末端修复，加A加接头。
   • 片段选择，PCR扩增、纯化（如果样本中存在污染物，则需要结合试剂盒进一步纯化）。 注：

4. 这个建库方法对mRNA的完整性有较高要求，因此如果mRNA发生降解，那么磁珠只能吸附靠近3’端的mRNA断片，会在富集阶段被洗脱，导致最后数据有一定的偏差（在RNA测序质控时就能发现mRNA的3’端以及5’端是否有偏移）。

5. 一般在会测序前对总RNA进行一次质检，根据电泳质检结果中的18S和28S（rRNA）两个峰的高度以及峰的尖度来判断RNA的质量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。

6. 除了mRNA普通文库构建外，还有真核链特异性文库、lncRNA文库、SmallRNA文库等

7. 针对一些FF(Formalin-Fixed)样本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蜡包埋样本以及原核生物的总RNA 中去除rRNA，不适合用上述mRNA建库方法。需要结合RiboZero、RiboMinus等来去除，其实是针对rRNA序列进行杂交捕获去除的原理 来去除的。

以上主要参考陈巍学基因视频： RNASeq方法及应用

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