在上一篇前沿显微成像技术专题——钙离子成像中我们为大家介绍了钙离子成像的相关原理和技术，不过由于它只能够检测已经产生的动作电位，无法涵盖阈下的膜电位变化，因此对于检测细胞电活动还是远远不够的。这种时候除了借助传统的电极记录技术之外，还有一种新兴的技术手段，将细胞电生理和成像相结合，也就是我们今天要给大家介绍的电压成像（Voltage imaging）。
电压成像原理
虽然听起来很高大上，但电压成像和钙离子成像的原理其实异曲同工。我们知道所有的动物细胞都细胞膜包围，胞内和胞外充满了数百万个离子：钠 (Na+)，钾(K+)，钙(Ca2+)，镁（Mg2+）氯(Cl -) 等等，而细胞膜上镶嵌的各种转运蛋白和跨膜离子通道可以控制这些离子进出细胞。从而形成持续存在的跨膜离子浓度梯度，由此形成的胞内外的电位差异就是膜电位。静息状态下的膜电位外正内负，此时的内外电位差称为静息电位。当细胞接受外界刺激时，离子会发生移动穿过细胞膜，结果就是令膜电位发生变化。生物体内的许多过程都伴随着膜电位的变化，如大脑中神经元之间的信号传递：当神经元被刺激，Na+迅速内流，膜电位发生去极化，变为外负内正，超过一定阈值就会产生动作电位，神经元被激活。
图1 细胞膜的展开图。细胞膜由两层磷脂组成，磷脂头部在外面，尾在里面。细胞膜内嵌有蛋白质、脂肪和碳水化合物，有些蛋白质只有一半镶嵌在细胞膜内，有些蛋白质则完全穿过细胞膜作为离子通道。
钙离子成像的原理就是通过钙离子指示剂反映钙离子浓度变化，从而反映动作电位，而电压成像是通过对电压敏感的荧光指示剂 (Voltage Indicators) 直接标记膜电位变化，再通过成像手段以图像的方式显示出来，因此可以检测到阈下电活动。
电压成像主要面临的挑战有两个：
1.速度快
神经元电信号的时间分辨率非常高（~1-2ms），成像系统需要更快的响应速度(亚毫秒级)，才能准确地反映数据
2. 信号弱
电压指示剂必须定位到膜上才能发挥作用。而细胞膜的体积比细胞的内外部小，可以采集到有效的信号的染料分子数量有限。
这两个挑战首先意味着我们使用的电压指示剂必须具有效率高，响应速度快的特点，且不破坏正常的细胞活性，因此对电压指示剂的选择也是电压成像的技术关键之一。下面我们就给大家介绍几种流行的电压指示剂。
电压指示剂
压敏染料
早期的压敏染料可大致分为两类，慢染料和快染料。慢染料对膜电位变化的反应以毫秒到秒为单位，适合测量细胞集群的静息电位，不能测量快速的神经元电信号。快速染料的反应速度在微秒内，并与膜电位的变化成比例，这使得它们的反应速度更快、可量化，但这些染料通常灵敏度也较低。传统的压敏染料具有很大局限性，它们不能靶向特定的细胞集群，会非特异性的标记所有细胞，导致信号会受到非目标信号的干扰。此外，压敏染料会导致细胞发生永久性的变化，甚至改变其光动力学性质，无法对活体动物进行长期观察。
基因编码电压指示剂
绿色荧光蛋白（GFP）的发现是生命科学尤其是成像领域的一个里程碑。受益于此，基因编码电压指示剂(GEVIs)也随即诞生，和压敏染料相比，GEVIs 最大的优势就是能够特异性的靶向细胞和蛋白，除此以外，GEVIs 不需要打开硬脑膜，手术损伤小，而且可以终生表达。有了它，科学家们就可以实现对大的活体动物或组织切片进行长时间的电压成像。
Iscaoff 和 Siegel 在1997年将 GFP 与钾通道融合，制造了第一个电压敏感荧光蛋白，称为 FlaSh。这就是第一代 GEVIs，其他还包括 VSFP1(2001) 和 SPARC(2002) 等。第一代 GEVIs 对细胞膜的靶向性较差，表达量也比较低，但为 GEVIs 奠定了基础。
第二代 GEVIs 是基于 Ci-VSP 这种蛋白的发现，它只有一个电压感应域，不像以前的钠/钾通道有四个，而且它可以独立工作。这使得指示剂更加简单，靶向性更好，如VSFP2(2007-2009)，也可以使用多种不同颜色的荧光蛋白(黄色、红色、青色)。但是这些 GEVIs 对膜电位的变化反应比较缓慢（图2）。为了克服这个缺点，科学家们将电压感应域与荧光蛋白之间的耦合增强，连接部分变短，开发出了新的第三代 GEVIs ，包括单色的 ASAP1 (St-Pierre et al. 2014) 和 FlicR1 (Abdelfattah et al. 2016) 以及双色的 VSFP-butterfly 家族 (Akemann et al. 2012; Sung et al. 2015)。它们的速度更快，能够准确分辨出快速的神经元信号。
图2 不同电压指示剂成像效果和细胞内记录的对比。第二代指示剂 VSFP2.3 (from Akemann et al. 2010)对电位变化的反应较慢, 而更新的 ArcLight Q175 (from Han et al. 2013)和 Ace2N-2AA-mNeon (from Gong et al. 2015)速度更快，对电压变化的响应更准确.
除了 VSFP 型指示剂，第三代 GEVIs 还有一种重要的类型就是 opsin（视蛋白）型，代表性的有 ArcLight 和 Ace2N-mNeon（图2）。2011年，Larry Cohen 和他的同事们发现可以通过改变膜电位来改变通道构象，进而改变视蛋白的荧光。Opsin（视蛋白）型 GEVIs 对电压的变化有很高的灵敏度，而且反应迅速。Opsin 与另外的荧光蛋白进一步结合，形成 opins - fp 荧光共振能量转移 (FRET) 对 GEVIs，即当两个荧光分子足够接近时交换能量，供体分子荧光减弱，受体分子发出荧光。膜电位的变化会改变视蛋白的光谱，从而产生便于检测的信号，大大增强了实验的灵活性。
下图对以上几种电压指示剂进行了总结：
图3 四种电压指示剂原理示意。A)小分子压敏染料附着在细胞膜上，并随着细胞膜电位的变化而改变荧光。B) 荧光蛋白融合到带有电压感应域的通道蛋白上，荧光根据膜电位变化而变化。C)荧光随膜电位变化而自然变化的视蛋白。D)可以实现FRET的Opsin-FP对——更加可定制化的GEVI。
相机选择
选择了满意的电压指示剂，如何采集到这些微弱而快速的信号呢？这就要借助高速高灵敏度的相机了——这也是电压成像的技术关键之一。
为了捕获和量化快速变化的电压信号，相机的速度首先要能满足采样电信号的要求，另外还需要极高的灵敏度才检测短曝光时间下微弱的信号。随着相机技术的不断发展，高速高灵敏度的背照式 sCMOS 相机 已经成为电压成像的最佳选择。它的主要竞争力体现在：
1. 高量子效率
背照式芯片带来95%量子效率，能够最大程度的接收和转换荧光信号。
2. 低读出噪声
超低读出噪声（可低至1e- 左右）降低相机的检测下限，即使在信号极弱的情况下也能拥有良好的图像信噪比。
3. 高帧率
随着CMOS相机技术的发展，相机速度已经可以达到几百甚至上千帧/秒），满足快速变化的电信号对采样率的要求。
由于电压成像既可以应用在大组织上进行环路水平的研究，也可以应用到单个细胞研究它们的电活动，在实验中最好将相机的像素大小与成像系统放大倍率匹配，以满足 Nyquist 采样定律（不记得这是啥？请复习做成像的你不能不了解的真相——分辨率中），得到分辨率最佳的图像。
电压成像是一种强大而灵活的技术，也是神经电生理的一个新的发展方向。和传统的电极记录相比，它的侵入性更小；和钙成像相比，它的速度快得多，能够更真实地反映神经元的活动。从小分子压敏染料到 FRET 基因编码电压指示剂，电压成像的近年来也在不断发展，能够以亚细胞级的空间分辨率和快速的时间分辨率呈现细胞信号，足以用于神经元信号检测，也已经在许多活细胞和大型模式动物的实验中得到了应用，相信未来电压成像会有更加广泛的应用前景。