前沿显微成像技术专题之：光片荧光显微镜(1)

　　在过去二十多年中，光学显微成像技术发展迅速，不断突破传统极限。生命科学研究，要求成像系统在不影响生物活性的前提下，实现更大视野，更高分辨率，更高速度的三维成像。这也意味着对成像探测器 - 科研相机的要求也越来越高。

　　首期我们的主角是近年来广受关注和发展的光片荧光显微镜（Light Sheet Fluorescence Microscopy） 。

光片荧光显微镜的诞生

大家知道，传统的宽场荧光显微镜通过物镜将激发光聚焦，同时收集样品的荧光信号成像。观察其照明方式(图1)不难发现，虽然焦平面上的光最强，但其上下的样品也会被照亮，导致以下局限性：

• 引入额外的光毒性，影响样品生物活性，甚至造成细胞死亡；
• 成像焦平面以外的干扰信号进入图像，导致图像分辨率和反差降低。

 

图1 宽场显微镜照明方式示意 (Brad Amos, Medical Research Council, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge)

　　激光扫描共聚焦使用点扫描方法，通过在探测端引入针孔，滤除了焦平面以外的杂散光，使分辨率，特别是Z轴方向的分辨率得到了提升，能够实现三维成像。但是，当激发光聚焦时，仍然会照亮上下区域（图2）。由于使用点扫描方式成像，为达到较快光的速度，光束照射每个点的时间很短，成像元件（PMT）的量子效率又很低，需要更强的激发功率。与传统宽场荧光显微镜相比，光漂白和光毒性更加严重。

 图2 激光扫描共聚焦照明方式示意：左图（单点被照亮时）右图（扫描成像）(Adapted from Brad Amos, Medical Research Council, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge)

　　1990年发明的双光子激光扫描显微镜是减少光毒性的一个好方法。由于使用近红外激光照明，对活体样品的光毒性大大降低，并且能够穿透更深的样品。但是，双光子的信号很弱，采集速度非常慢，不适合对大样品进行动态成像。而且其昂贵的成本也限制了应用范围。

听起来要同时满足大视野，高分辨率，高速度和低的光损伤是一件令人头秃的事，不过这是难不倒科学家们的。
事实上早在1903年，席格蒙迪（Richard Zsigmondy）和西登托夫（Henry Siedentopf）就发明了通过一个狭缝生成光片照明的超显微镜(Ultra microscope)，但是他们的方法并未进一步发展到荧光成像。
直到1993年，华盛顿大学Voie和他的同事提出了正交平面荧光切片技术 (Orthogonal Plane Fluorescence Optical Sectioning，OPFOS)。
2004年，Ernst Stelzer和同事进一步发展了这个idea，搭建出一台新的荧光显微镜，他们称之为SPIM(单平面照明显微镜, Selective / Single Plane Illumination Microscopy)，也就是我们现在所知道的光片荧光显微镜。

什么是“光片”？

　　光片显微镜与传统显微镜的不同在于激发光的照明方式。它的照明光是一张与成像面平行的薄薄的“光片”(图3)，只有焦平面的样品被照亮，而其上下的样品不受影响。

 图3 光片显微镜照明方式示意

和传统荧光照明方式相比，光片照明有如下优点：

1. 提高了图像和背景的反差(Signal-to-Background Ratio) 和轴向分辨率：光片照明技术保证了焦平面上下的样品不会被激发，具备和共聚焦显微镜类似的光学切片功能；
2. 减少了光漂白和光毒性：与传统的荧光照明技术相比，光毒性可以被降低20-100倍，这样，我们就能在更接近生理状态的条件下，对活体生物样品进行长时间的三维成像；
3. 与激光共聚焦和双光子显微镜使用低QE的PMT的点扫描成像相比，光片显微镜使用高QE的CCD或sCMOS相机进行面成像，大大提高了成像速度和图像的信噪比。共聚焦需要几分钟甚至几小时才能拍完的样品，用光片显微镜只需要几秒到几分钟。因此，光片显微镜也特别适合用于大样品成像。

　　在多数光片系统中，光学元件是固定的，需要移动样品 (或使光片从xyz方向扫过样品) 来获得完整的3D图像。通过移动或旋转样品，可以对大样品进行成像，并从多个角度拍摄，将这些多视角图像通过特别算法融合在一起后，能够进一步提高图像分辨率，并修正一些光片技术特有的缺陷。

　　总之，光片荧光显微镜从设计原理上，大大降低了激发光对活体样品的光毒性和光漂白，天生具有光学切片能力，使用高量子效率的CCD或sCMOS探测器，是大视野，高速，高分辨率三维活体显微成像的理想工具。

“光片”的实现

　　产生光片最简单的方法是在光路中引入一个圆柱形透镜。通过该透镜的光，宽度维持不变，但在高度上被压缩成平面 (图4)，然后通过照明物镜，在焦面上形成“光片”。成像物镜垂直于照明物镜放置，并聚焦在光片上获取荧光信号。

 　　使用这种方法生成的光片，其宽度和厚度由照明物镜的NA值决定。如图5所示，照明光束的实际形状是一个两头宽，中间细的“沙漏”形。ω0为光束腰厚度，也就是光片厚度，b为均匀照明宽度，也就是有效视野。

 图5 光片特性（箭头指示激发光束的方向）

有如下公式：

因此，使用NA较小的照明物镜，能够实现较宽范围的均匀照明，即视野更大；但是相应的，光片的厚度也越大，导致轴向分辨率降低。而高NA物镜产生的光片视野会比较小，但轴向分辨率较好。

要注意的是，如果成像物镜的NA值很高，使得其景深小于光片的厚度，那么系统的轴向分辨率主要是由成像物镜的景深决定。但这时会产生普通荧光照明时具有的问题，即焦面上下的部分样品会被照亮，不必要的光毒性和杂散光会对成像效果产生负面影响。
如果成像物镜的NA值较低，光片厚度比它的景深要小，那么系统的轴向分辨率就由光片的厚薄来决定。