转录组差异表达分析小实战（二）
差异基因表达分析
我按照前面的流程转录组差异表达分析小实战（一），将小鼠的4个样本又重新跑了一遍，从而获得一个新的count文件：mouse_all_count.txt，有需要的话，可以下载下来进行后续的差异分析。
一般来说，由于普遍认为高通量的read count符合泊松分布，所以一些差异分析的R包都是基于负二项式分布模型的，比如DESeq、DESeq2和edgeR等，所以这3个R包从整体上来说是类似的（但各自标准化算法是不一样的）。
当然还有一个常用的R包则是Limma包，其中的limma-trend和limma-voom都能用来处理RNA-Seq数据（但对应适用的情况不一样）
下面准备适用DESeq2和edgeR两个R包分别对小鼠的count数据进行差异表达分析，然后取两者的结果的交集的基因作为差异表达基因。
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DEseq2
library(DESeq2) ##数据预处理 database <- read.table(file = "mouse_all_count.txt", sep = " ", header = T, row.names = 1) database <- round(as.matrix(database)) ##设置分组信息并构建dds对象 condition <- factor(c(rep("control",2),rep("Akap95",2)), levels = c("control", "Akap95")) coldata <- data.frame(row.names = colnames(database), condition) dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData=database, colData=coldata, design=~condition) dds <- dds[ rowSums(counts(dds)) > 1, ] ##使用DESeq函数估计离散度，然后差异分析获得res对象 dds <- DESeq(dds) res <- results(dds) #最后设定阈值，筛选差异基因，导出数据(全部数据。包括标准化后的count数) res <- res[order(res$padj),] diff_gene <- subset(res, padj < 0.05 & (log2FoldChange > 1 | log2FoldChange < -1)) diff_gene_DESeq2 <- row.names(diff_gene) resdata <- merge(as.data.frame(res), as.data.frame(counts(dds, normalized=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE) write.csv(resdata,file = "control_vs_Akap95.csv",row.names = F)最终获得572个差异基因（筛选标准为padj < 0.05, |log2FoldChange| > 1）
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edgeR
library(edgeR) ##跟DESeq2一样，导入数据，预处理（用了cpm函数） exprSet<- read.table(file = "mouse_all_count.txt", sep = " ", header = TRUE, row.names = 1, stringsAsFactors = FALSE) group_list <- factor(c(rep("control",2),rep("Akap95",2))) exprSet <- exprSet[rowSums(cpm(exprSet) > 1) >= 2,] ##设置分组信息，并做TMM标准化 exprSet <- DGEList(counts = exprSet, group = group_list) exprSet <- calcNormFactors(exprSet) ##使用qCML（quantile-adjusted conditional maximum likelihood）估计离散度（只针对单因素实验设计） exprSet <- estimateCommonDisp(exprSet) exprSet <- estimateTagwiseDisp(exprSet) ##寻找差异gene(这里的exactTest函数还是基于qCML并且只针对单因素实验设计)，然后按照阈值进行筛选即可 et <- exactTest(exprSet) tTag <- topTags(et, n=nrow(exprSet)) diff_gene_edgeR <- subset(tTag$table, FDR < 0.05 & (logFC > 1 | logFC < -1)) diff_gene_edgeR <- row.names(diff_gene_edgeR) write.csv(tTag$table,file = "control_vs_Akap95_edgeR.csv")最终获得688个差异基因（筛选标准为FDR < 0.05, |log2FC| > 1）
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取DESeq2和edgeR两者结果的交集
diff_gene <- diff_gene_DESeq2[diff_gene_DESeq2 %in% diff_gene_edgeR]最终的差异基因数目为545个
head(diff_gene) [1] "ENSMUSG00000003309.14" "ENSMUSG00000046323.8" "ENSMUSG00000001123.15" [4] "ENSMUSG00000023906.2" "ENSMUSG00000044279.15" "ENSMUSG00000018569.12" -
其他两个R包（DESeq和limma）就不在这尝试了，我之前做过对于这4个R包的简单使用笔记，可以参考下：
简单使用DESeq做差异分析
简单使用DESeq2/EdgeR做差异分析
简单使用limma做差异分析
GO&&KEGG富集分析
以前一直没有机会用Y叔写的clusterProfiler包，这次正好看说明用一下。
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GO富集，加载clusterProfiler包和org.Mm.eg.db包（小鼠嘛），然后将ENSEMBL ID后面的版本号去掉，不然后面不识别这个ID，然后按照clusterProfiler包的教程说明使用函数即可。
library(clusterProfiler) library(org.Mm.eg.db) ##去除ID的版本号 diff_gene_ENSEMBL <- unlist(lapply(diff_gene, function(x){strsplit(x, "\.")[[1]][1]})) ##GOid mapping + GO富集 ego <- enrichGO(gene = diff_gene_ENSEMBL, OrgDb = org.Mm.eg.db, keytype = "ENSEMBL", ont = "BP", pAdjustMethod = "BH", pvalueCutoff = 0.01, qvalueCutoff = 0.05) ##查看富集结果数据 enrich_go <- as.data.frame(ego) ##作图 barplot(ego, showCategory=10) dotplot(ego) enrichMap(ego) plotGOgraph(ego) -
KEGG富集，首先需要将ENSEMBL ID转化为ENTREZ ID，然后使用ENTREZ ID作为kegg id，从而通过enrichKEGG函数从online KEGG上抓取信息，并做富集
library(clusterProfiler) library(org.Mm.eg.db) ##ID转化 ids <- bitr(diff_gene_ENSEMBL, fromType = "ENSEMBL", toType = "ENTREZID", OrgDb = "org.Mm.eg.db") kk <- enrichKEGG(gene = ids[,2], organism = "mmu", keyType = "kegg", pvalueCutoff = 0.05, pAdjustMethod = "BH", qvalueCutoff = 0.1) ##查看富集结果数据 enrich_kegg <- as.data.frame(kk) ##作图 dotplot(kk)
到这里为止，转录组的差异表达分析算是做完了，简单的来说，这个过程就是将reads mapping 到reference上，然后计数获得count数，然后做差异分析，最后来个GO KEGG，over了。。。
对于mapping和计数这两部还有其实还有好多软件，具体可见文献：Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis，有时间可以都尝试下。
至于GO && KEGG这两步，对于人、小鼠等模式物种来说，不考虑方便因素来说，完全可以自己写脚本来完成，数据可以从gene ontology官网下载，然后就是GO id与gene id相互转化了。KEGG 也是一样，也可以用脚本去KEGG网站上自行抓取，先知道URL规则，然后爬数据即可。