关于RNA-Seq数据去接头(Adapter)这事需要讲一讲

关于RNA-Seq数据去接头(Adapter)这事需要讲一讲

• RNA-Seq
 
• adapter
 
• barcode
 
• cutadapt

首先来了解一下三个概念： 1、adapter是一段短的序列已知的核酸链，用于链接序列未知的目标测序片段。 2、barcode，也称为index，是一段很短的寡居核酸链，用于在多个样品混合测序时，标记不同的样品。 3、insert是用于测序的目标片段，因为是包括在两个adapter之间，所以被称为“插入”片段。

首先来了解一下三个概念：

1、adapter是一段短的序列已知的核酸链，用于链接序列未知的目标测序片段。

2、barcode，也称为index，是一段很短的寡居核酸链，用于在多个样品混合测序时，标记不同的样品。

3、insert是用于测序的目标片段，因为是包括在两个adapter之间，所以被称为“插入”片段。

一个常见测序片段类似与adapter--barcode--insert--adapter。测序开始时前几个碱基无法测得，第一个adapter在数据输出时被去除；由于测序仪读长限制，第二个adapter通常无法测得。所以，经常得到类似 barcode--部分insert的read。最后，把barcode去除，只保留测度insert的片段，这个操作的术语是demultiplexing。但是有时候测序时会测穿，也就是说会得到barcode--insert的read--部分adapter，那么这里就包含了接头了，这里的接头也就是大家经常说去接头要去除的部分。

有了以上思路之后，如何去除接头应该就心里有数了，不要照抄网上的教程，没有理解原理有些教程用到你根本不行，虽然有时候你可能按照网上教程不报错并且会看到去除了些，但是这才是最坑的，没去除干净你自己也发觉不了，这还不是最坏的，毕竟接头含量大多数时候较少影响不大，但是如果你做组装或者人品不好的时候，结果就会很出乎意料。

扯这么多，是因为踩过网上教程的坑，现在回归正题

假设我有一个双端测序的数据，最原始的没有去除接头的，然后公司也告诉了我接头序列

接头序列：

    adapt1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

     _REV:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT

    adapt2:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

    NNNNNN：barcode

barcode：

以上咱们已经了解了这个数据的基本情况，下一步咱们使用cutadapt进行去除接头操作

跟进cutadapt教程主要有几个参数：

-a：左端reads的接头

-A：右端reads的接头，注意右端出现的接头是因为侧穿了，所以他的接头序列是左端reads的接头的反向互补序列

-m：表示去除接头后如果read长度小于这个m值就不要了

--pair-filter：采用双末端模式来去除接头，保持两端数据匹配

完整命令如下：

cutadapt -a adapt2 -A adapt1_REV -m 20 --pair-filter=both -o out_fq1 -p out_fq2 fq1 fq2

例子完整命令:

先安装cutadapt：

pip install cutadapt

按照上面流程进行构建命令：

cutadapt -a GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAGTCAAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG -A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT -m 50 --pair-filter=both -o Sample1_combined_rmAD_R1.fastq -p Sample1_combined_rmAD_R2.fastq Sample1_combined_R1.fastq Sample1_combined_R2.fastq

结果如下：