GenePix Pro 3.0 是由 Axon Instruments(www.axon.com) 公司所开发之快速且具高质量的 DNA 微数组扫瞄工具,它也提供微数组数据的获取和分析软件。
GenePix 4000 系列扫瞄器利用同步双雷射(dual-laser)扫瞄系统及时产生比例影像(ratio image),此比例影像是标准的 24 位红、绿、蓝色合成影像,它们的内定值分别为 635、532及 0 nm 之雷射光。如果我们将参考组(reference)与检测组(test)的 cDNA 分别标示为 Cy3 (绿光) 和 Cy5(红光),若比例影像呈现红色,则表示检测组之cDNA的表现量高于参考组;反之,若为绿色,则表示检测组之cDNA的表现量低于参考组;若两者差异不大时,则以黄色呈现。然而,为使基因表现以数量化型式呈现,我们可以定义比例影像为红光强度除以绿光强度,亦即Cy5/Cy3,其值大于(小于) 1,表示检测组之cDNA的表现量高(低)于参考组。
GenePix Pro 3.0 将玻片上每一 DAN 斑点(inividual spot)称作feature,并在feature上划出一适当的圆形区域,称之为feature-indicator,它是GenePix Pro 3.0数据分析的基本单位。首先将整个玻片划分为格子状之映像点(pixel),利用这些原始影像上映像点之雷射光表现量可以计算各个feature-indicator的平均值、中位数及标准差。另外,以每一feature-indicator为中心,并以其直径之3倍为直径画出一圆,利用落于此圆内、斑点外之映像点的雷射光表现量计算背景光强度之平均值、中位数及标准差。尔后GenePix Pro 3.0 计算每一feature-indicator比例影像值时,均先减去其各自背景光强度之中位数。
GenePix Pro 3.0 提供的比例影像值包括中位数比值(ratio of medians)、平均数比值(ratio of means)、比例的百分位数(quantities derived from pixed-by-pixel ratios)、比例的中位数(median of ratios)、比例的平均数(mean of ratios)及回归比例(regression ratio),其定义分别如下:
中位数比值 (对某个Feature,n表示其中的pixel格式,m表示背景pixel的个数;GenePix Pro 4.0.1.17已经核对正确)
平均数比值 (对于某个Feature,Feature以内的每个pixel;无法核对)
比例的百分位数 (与上一个公式类似,对于某个Feature,Feature以内的每个pixel;无法核对)
比例的中位数 (与上一个公式类似,对于某个Feature,Feature以内的每个pixel;无法核对)
比例的平均数 (与上一个公式类似,对于某个Feature,Feature以内的每个pixel;无法核对)
回归比例 : 不要严格区分 feature 与背景光强度,直接做 Cy5 与 Cy3 之比例,或是找出 Cy5 与 Cy3 间的回归系数。
GenePix Pro 3.0 的数据质量的检测方式有,中位数和(sum of medians)、平均数和(sum of means)、比例的对数值(Log ratio)及Flags,其定义分别为:
中位数和 (GenePix Pro 4.0.1.17已经核对正确)
如果我们发现中位数和或平均数和不合理地异常小,表示参考组与检测组的基因于此实验仅有微量表现;因此,利用比例影像值分析数据,在解释时需格外留意,以免有误导情势发生。
比例的对数值 (GenePix Pro 4.0.1.17核对不一样;结果为log2((Cy5IMed-Cy5BMed)/(Cy3IMed-Cy3BMed)))
Flag :影像数据经过 GenePix Pro 3.0 内部粗略分析后,它会标示出 “Bad”、“Good”、“Absent”及“Not Found”,并且分别以数值 “-100”、“ +100”、 “-75” 和 “-50” 表之;“Bad” 代表数据不合规格,“Good” 表示资料符合我们实验的要求, “Absent” 为数据数组表的某一feature是遗漏数据(missing data), “Not Found” 表示feature-indicator在自动排列时有缺失。
GenePix Pro 3.0 对于前述比例影像值(中位数比值、平均数比值、比例的中位数、比例的平均数及回归比例)提供数据正规化(data normalization)的正规化因子(normalization factor)为